菏泽地区新生儿G6PD缺乏症基因突变的检测

张鑫 刘朔 李苗苗 王凤琦 张仁伟 刘世国

［摘要］ 目的 探究菏澤地区新生儿葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症患病率特点及其基因突变的特点。

方法 应用GSP全自动荧光免疫分析仪，对2021年1—12月在菏泽地区出生的新生儿G6PD活性进行筛查。使用天根生物DP334（离心柱型）试剂盒对确诊病儿的干血斑标本提取基因组DNA，采用PCR产物直接测序技术进行G6PD基因全部外显子测序，分析菏泽地区新生儿G6PD缺乏症基因突变类型与特点。

结果 菏泽地区77 141例新生儿中检测出G6PD缺乏症确诊病儿54例，患病率为0.07%；
54例病儿的G6PD基因全部外显子突变共检出13种突变类型，基因突变检出率为100%。首次在中国人群中发现1个G6PD基因内含子变异：G6PD c.486－7C＞G；
其余12种是已有报道的中国人群G6PD突变类型。其中男性半合子13型，女性杂合子4型。81.48%的G6PD突变位于12、6、9、2号外显子上，其中c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T占77.78%，菏泽地区新生儿G6PD缺乏症的基因突变热点依次为：c.1388G＞A（29.63%）、c.487G＞A（22.22%）、c.1376G＞T（11.11%）。

结论 菏泽地区新生儿G6PD缺乏症患病率和基因突变的类型有其地域特点。

［关键词］ 葡糖磷酸脱氢酶缺乏；
荧光免疫分析；
DNA突变分析；
婴儿，新生

［中图分类号］ R722.11

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0174－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.050

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［ABSTRACT］ Objective To investigate the prevalence rate and gene mutations of glucose－6－phosphate dehydrogenase （G6PD） deficiency in neonates in Heze， China.

Methods GSP automatic fluorescence immunoassay system was used for the screening of G6PD activity in the neonates born in Heze from January to December， 2021. Tiangen Biological DP334 （centrifugal column） kit was used to extract genomic DNA from the dried blood spot samples from the children with a confirmed diagnosis， and the direct PCR product sequencing technique was used for the sequencing of all exons of the G6PD gene to investigate the types and characteristics of gene mutation in G6PD deficiency in Heze.

Results Among the 77 141 neonates in Heze，54 were diagnosed with G6PD deficiency， with a prevalence rate of 0.07%， and 13 mutation types were detected in all exon mutations of the G6PD gene， with a detection rate of 100%. One intron variation of the G6PD gene， G6PD c.486－7C>G， was found for the first time in the Chinese population， and the other 12 mutations of the G6PD gene had been reported in the Chinese population. Among these mutations， there were 13 hemizygous mutations in males and 4 heterozygous mutations in females. The analysis showed that 81.48% of G6PD mutations were located in exons 12，6，9 and 2， among which c.1388G>A， c.487G>A， c.1376G>T， c.95A>G， and c.1024C>T accounted for 77.78%. The hot spots of mutation in neonates with G6PD deficiency in Heze were c.1388G>A （29.63%）， c.487G>A （22.22%）， and c.1376G>T （11.11%）.

Conclusion The prevalence rate and gene mutation types of neonatal G6PD deficiency in Heze have their own regional characteristics.

［KEY WORDS］ glucosephosphate dehydrogenase deficiency; fluoroimmunoassay; DNA mutational analysis; infant， newborn

葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种常见的、由G6PD基因突变而导致的X性连锁不完全显性的遗传性红细胞酶缺陷病，在临床上导致溶血性贫血的发生。G6PD基因位于X染色体长臂2区8带（Xq28），由13个外显子（其中第1个外显子属于非编码）和12个内含子组成，编码515个氨基酸长度的蛋白质。G6PD是一个关键性的调节酶，其功能是调节糖酵解并在磷酸戊糖途径（PPP）的过程中产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），而这也是NADPH的主要的来源途径。

G6PD基因突变后，携带该突变基因的女性可将突变的等位基因传递给其子或女，而对于父亲来说只能传递给女儿。依据酶活性和临床表现，WHO将G6PD缺乏症分为Ⅰ～Ⅴ共5级。本研究对菏泽地区新生儿G6PD缺乏症筛查患病率及基因突变情况进行分析，旨在为该病的筛查、诊断、治疗等提供参考。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2021年1—12月，选取在菏泽地区出生的共计77 141例新生儿作为研究对象，通过GSP全自动荧光免疫分析仪筛查并召回检测确诊的G6PD缺乏症病儿。本文研究经青岛大学附属医院医学伦理委员会批准实施，家长均在新生儿疾病筛查前签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 檢测仪器 GSP全自动荧光免疫分析仪（GSP，Genetic Screening Processor，型号为2021－0010）；
美国莱伯特LABNET Enduro水平电泳系统；
美国UV凝胶成像系统（BIO－RAD）；
PCR扩增仪（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler，美国）；
ABI Prism 3730XL型基因分析仪（DNA测序仪，美国ABI公司）。

1.2.2 试剂盒 G6PD测定试剂盒（GSP Neonatal G6PD kit，荧光分析法）；
干血斑DNA提取试剂盒（TIANamp Blood Spots DNA Kit，离心柱型）；
庄盟ZOMANBIO DL 2000 Plus DNA Marker；
诺唯赞Vazyme 2×Rapid Taq Master Mix试剂盒。

1.3 研究方法

1.3.1 G6PD缺乏症筛查方法 采集新生儿足跟血液，要求：①于新生儿生后72 h～7 d之内采血；
②采血前必须充分哺乳6次以上；
③血液直接滴到滤纸上制备血片，自然晾干，避免污染，晾干后4 ℃或冷冻密封保存。应用GSP全自动荧光免疫分析仪，检测新生儿血G6PD水平。若新生儿血红蛋白G6PD<27 U/g，打电话召回重新采集足跟血制备干血斑片复查，如果3次复查（间隔1周）血红蛋白G6PD均<27 U/g则确诊为G6PD缺乏症。

1.3.2 DNA提取 严格按照干血斑DNA提取试剂盒的方法提取病儿干血斑片的基因组DNA，取2 μL，在核酸蛋白分析仪上检测其浓度和纯度。

1.3.3 基因突变检测 根据NCBI Reference Sequence：NM_001360016.2设计G6PD引物序列，应用primer express 3.0设计9对引物，扩增产物长500～896 bp，其中Exon3～4、Exon6～7、Exon9～10、Exon11～12合并扩增，见表1。构建PCR反应体系：上、下游引物各1.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，蒸馏水5.5 μL，提取的DNA样品溶液5.0 μL。反应条件：先50 ℃孵育2 min，然后95 ℃孵育3 min；
95 ℃变性15 s， 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，经历35次循环；
之后75 ℃延伸5 min。扩增完成以后，取PCR扩增产物3 μL，在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，反应条件为：110 V，35 min。电泳完成后，使用凝胶成像仪成像，经鉴定是本研究所需要的DNA片段后，送青岛派森诺基因科技有限公司进行一代基因测序并分析。

2 结果

2.1 菏泽地区新生儿G6PD缺乏症患病率的特点

菏泽地区2021年1—12月出生的7 7141例新生儿中，经筛查并确诊G6PD缺乏症病儿54例，总患病率为0.07%，其中男50例，女4例。菏泽地区各县区G6PD缺乏症的患病率情况见表2。根据WHO的分类标准，Ⅱ类占1.85%，Ⅲ类占74.07%，Ⅳ类占24.07%。见表3。

2.2 菏泽地区新生儿G6PD缺乏症基因突变的情况

对54例确诊病儿进行G6PD基因全部外显子测序分析显示，基因突变检出率为100%，共发现13种突变类型，其中12种G6PD突变类型在中国人群中已报道过，分别为：c.1388G＞A，c.487G＞A，c.1376G＞T，c.95A＞G，c.1024C＞T，c.871G＞A，c.392G＞T，c.1192G＞A，c.486－34delT，c.1360C＞T，c.592C＞T，c.196T＞A；
1种为在中国人群中未见报道的内含子变异：Intron5上c.486－7C＞G（图1）；
其中男性半合子13型，女性杂合子4型。81.48%的G6PD突变位于12、6、9、2号外显子上，其中c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T占77.78%，菏泽地区的突变热点依次为：c.1388G＞A 29.63%，c.487G＞A 22.22%，c.1376G＞T 11.11%。见表4。

3 讨论

常规检测G6PD缺乏症酶学的技术有很多，常用的筛查方法包括G6PD全自动荧光免疫分析法、硝基四氮唑蓝纸片实验方法、G6PD/6PGD比率法、高铁血红蛋白还原试验等。G6PD/6PGD比率法是WHO推荐的G6PD缺乏症筛查方法，该方法操作比较简单，检测结果的准确度也比较高，而且具有可检测出更多的杂合子类型的优点，所以该方法在国际上应用非常广泛。除了可以进行G6PD酶活性定量的检测，也可以对G6PD缺乏症的基因突变进行PCR产物直接测序，更加有利于在分子水平上对G6PD缺乏症进行分析研究。另外，由于全自动荧光免疫分析法可检测样本量大和自动化程度比较高，特异度与灵敏度也比较高，目前，该法在临床上对新生儿遗传代谢性疾病筛查中已被大多数的实验室所采用。WHO Ⅰ类酶活性范围为0，病人临床表现为无明显诱因情况下就会出现中度贫血、黄疸，肝脾大；
Ⅱ类酶活性的范围一般<10%，会出现间断性的溶血发作，在食用某些食物（如蚕豆）、感染、氧化药物和一些草药可能会诱发急性溶血；
Ⅲ类酶活性范围为 10%～60%，病人临床表现为少数伯氨喹类药物或者感染可以引发溶血；
Ⅳ类酶活性范围＞60%，病人无特殊临床表现；
Ⅴ类酶活性范围＞200%，病人无特殊临床表现。相关统计数据表明，世界上G6PD缺乏症病人大约有4亿人，呈全球性分布，总患病率约5%。另外有研究显示，1990—2013年，每年平均有4 100人因为G6PD缺乏症而死亡。从全世界来看，G6PD缺乏症分布呈现出不平衡的状态，在北美和欧洲发生率低于3%，而在非洲、亚洲、南美洲部分地区、地中海、中东等热带和亚热带地区发病率显著增加，其发病率可高达15%～26%。我國新生儿遗传代谢病筛查（NBS）始于20世纪80年代，G6PD缺乏症在我国儿童总体患病率为4.03%。我国华南及西南各地区如广东、广西、云南、海南等G6PD缺乏症常见，是该病的高发区之一，并呈“南高北低”的梯度分布趋势。文献报道，广东省G6PD缺乏症儿童患病率为3.1%～16.1%，广西为7.40％，云南省为7.39%，贵州省为3.43%；
而G6PD缺乏症在我国北方地区的山东青岛（患病率为0.02%）、山东聊城（患病率为0.02%）、陕西宝鸡（患病率为0.02%）、河北省石家庄（患病率为0.05%）患病率较低。本研究表明2021年1—12月菏泽地区G6PD缺乏症总患病率为0.07%，与该病发生率具有种族及地域差异、在我国存在“南高北低”的特点相符。本文研究结果显示，G6PD缺乏症郓城县和鄄城县患病率为0.12%，巨野县患病率为0.01%，表明菏泽地区各县区新生儿G6PD缺乏症筛查患病率亦有地域差异性。

目前，全世界已经发现存在约220种G6PD基因缺陷等位基因，其分布具有明显的地区和民族异质性等特点。既往有研究表明，缅甸地区常见的G6PD基因突变为c.487G＞A，在非洲地区人群中G6PD基因突变常见的类型则以c.202G＞A、c.变为c.563G＞T，泰国和马来西亚常见的基因突变为c.871G＞A，印尼安汶人中常见的基因突变为c.383T＞C，夏威夷州菲律宾裔居民常见的基因突变为c.1360C＞T。而在我国，G6PD缺乏症的患病率和基因突变类型明显具有地域和群体特异性。中国人突变位点主要是c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G，分布在我国多个民族中。本研究共检出13种突变类型，其中有12种G6PD突变类型c.1388G＞A、c.487G＞A、c.1376G＞T、c.95A＞G、c.1024C＞T、c.871G＞A、c.392G＞T、c.1192G＞A、c.486－34delT、c.1360C＞T、c.592C＞T、c.196T＞A在中国人群中已报道过；
菏泽地区的突变热点依次为：c.1388G＞A（29.63%）、c.487G＞A（22.22%）和c.1376G＞T（11.11%）。通过检索MasterMind和NCBI Clinvar以及中国国家基因组数据库，本研究发现1种在中国人群中未见报道的G6PD基因内含子变异：c.486－7C＞G，该例病儿只有此1种基因变异，并且在Exon6前7个碱基处发生碱基替换，可能影响G6PD蛋白的剪接，为可能致病变异。提示菏泽地区新生儿G6PD缺乏症基因突变的类型有其地域特点。

综上所述，菏泽地区新生儿G6PD缺乏症患病率较低，为0.07%；
G6PD缺乏症患病率和基因突变的类型有地域特点，通过对G6PD基因全部外显子进行测序能够进一步明确基因突变位点的分布情况。本研究发现了1种G6PD基因新突变，丰富了G6PD基因突变的数据库，为该病的预防以及治疗提供了更加丰富的可供临床参考的资料。

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（本文编辑 黄建乡）

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