萝卜与甘蓝型油菜远缘杂交形成新种质的研究与探讨

万林生， 孙红芹， 倪正斌， 韩配配， 陈志爱

(江苏沿海地区农业科学研究所， 江苏 盐城 224012)

远缘杂交是创造作物新品种的重要途径，也是改良物种的有力工具。利用远缘杂交技术，可打破种、属间的隔离，拓宽遗传基础并为育种计划创造新的种质，从而有效地进行种间、属间目标遗传物质的转移。目前，远缘杂交在油菜育种上已得到广泛应用，并取得显著成效。如用白菜型油菜与甘蓝型油菜杂交，改良甘蓝型油菜的熟性；
甘蓝型油菜与白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘蓝等黄籽材料杂交，在杂交后代中选育出黄色种皮的甘蓝油菜等[1-4]。

目前，国内外在甘蓝型油菜与萝卜远缘杂交及杂种鉴定方面的研究虽有报道，却为数不多。甘蓝型油菜是经过白菜与甘蓝种间杂交，加倍形成的异源双二倍体，而萝卜是十字花科一种非常重要的蔬菜。甘蓝型油菜与萝卜的杂交属于芸薹属与萝卜属之间的远缘杂交[5-6]。萝卜属作为芸薹属的近缘属，具有许多优秀并有价值的基因，例如优良的抗逆、抗虫性和抗病性。远缘杂交可以将萝卜中的优良基因转移到甘蓝型油菜中，从而拓宽甘蓝型油菜的遗传基础，改良甘蓝型油菜。

本试验通过人工杂交获得甘蓝型油菜与萝卜的远缘杂种，并对杂种进行了分子标记鉴定，旨在拓宽甘蓝型油菜的遗传基础，为相关性状的转移和创造新的生物材料提供理论依据。

1.1 试验材料

供试材料为油菜和萝卜。油菜品种(母本)为甘蓝型油菜Y5A、Y4-2A，均为江苏沿海地区农业科学研究所自育油菜核不育品种;萝卜品种(父本)为吉美红皮、牛埔杙、春露、短叶十三，均为引进中国油料作物研究所萝卜高抗根肿病品种。

1.2 试验方法

1.2.1 远缘杂交

在江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验场内根据萝卜和油菜的生育期长短播种，以保证其花期相遇。以甘蓝型油菜Y5A、Y4-2A为母本，以4种萝卜品种为父本，共8组杂交组合。2021年4月开展油菜萝卜杂交工作。将母本不育系套袋，当袋子中的母本开花十几朵后，取父本萝卜当天开放的新鲜花粉，涂抹在母本花朵柱头上，套上杂交纸袋，挂好吊牌。授粉后1周去除纸袋。成熟时按组合和母本单株收获，计数每一花序的结角数、每角的饱满粒数、半饱满粒数和瘪粒数，并计算结角率与亲和指数。

结角率=100%×获得的角果数/授粉花朵数；
亲和指数=饱满种子数/授粉花朵数。

1.2.2 分子标记鉴定F1真假杂交种

通过对甘蓝型油菜、萝卜及两者的杂交F1代种子进行萌发和试验培养，利用杭州博日的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取亲本及其F1杂交种叶片的DNA。对亲本基因组DNA进行高通量测序，组装基因组信息并搜索全基因组中的SSR位点，并设计合成这些特异性位点相对应的引物，利用亲本和杂交种的基因组DNA进行PCR扩增，确定引物的特异性、有效性，挑选出最合适引物用于杂交种的真实性鉴定。

2.1 远缘杂交

由表1可以看出，甘蓝型油菜Y5A为母本，以4种萝卜品种为父本，得到23个角果，平均结角率0.07%。收获后考种，得到杂交种子44颗，平均亲和指数0.12。4个杂交组合中，Y5A/吉美红皮没有获得杂交种子，Y5A/春露的杂交种子数最多，为 31颗，结角率0.15%，亲和指数0.32。

表1 8个杂交组合田间结实情况

由表1可以看出，甘蓝型油菜Y4-2A为母本，以4种萝卜品种为父本，得到11个角果，平均结角率0.04%。收获后考种，得到杂交种子21颗，平均亲和指数0.08。4个杂交组合中，Y4-2A/吉美红皮没有获得杂交种子，Y4-2A/春露的杂交种子数最多，为 12颗，结角率0.06%，亲和指数0.14。

2.2 F1杂交种验证

对甘蓝型油菜和萝卜进行基因组测序，从全基因组中的SSR位点及其设计的相对应引物里筛选了150对引物，利用这150对引物与甘蓝型油菜(母本)、萝卜(父本)及8株杂交F1代基因组DNA进行PCR扩增。初步筛选出在父母本间能扩增出清晰的特异性条带的引物。再用筛选出的引物同时与亲本和杂交F1代DNA进行PCR扩增，挑选出能在杂交F1代表现出同时具有父母本特异性条带的合适引物，进行杂交种的真实性鉴定。

2.2.1 SSR引物筛选

2.2.1.1 亲本和F1DNA提取

利用改良CTAB法提取亲本和F1代幼嫩叶片的DNA。首先在磨样机中加入一定量的幼嫩叶片及两颗钢珠，700 μL预热的CTAB，磨样机50 Hz磨样3 min。随后65 ℃水浴30 min。水浴后加入氯仿700 μL，剧烈振荡，离心机12 000 r·min-1离心10 min，取500 μL上清液，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒几次，离心机12 000 r·min-1离心15 min。弃上清，加入适量的70%乙醇，振荡，静置。5 min后轻轻倒掉乙醇，放在卫生纸上倒置过夜。第二天加TE缓冲液200 μL，测定DNA含量。

2.2.1.2 分子标记开发

通过NCBI数据库分别查找下载油菜(Radish_ v2.20)与萝卜(Bra_napus_v2.0)的基因组序列，利用软件BioEdit v.7.7.3.0 版本建立各自的基因组序列库。使用萝卜的某条染色体与其整个基因组序列对比，截取匹配程度低的部分。再使用所截取序列与甘蓝型油菜基因组比对，在序列差异位置开发显性标记。通过对比筛选，使该标记特异于油菜基因型序列和萝卜的其他染色体。

PCR反应结束后进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压150 V，时间35 min，上样量5 μL。

最后筛选出5对引物，5对引物序列如下：

Primer17-F：5′-CCAATCCGACGATACAGGTT-3′；
SEQ ID NO.1；

Primer17-R：5′-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3′；
SEQ ID NO.2；

Primer51-F：5′-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3′；
SEQ ID NO.3；

Primer51-R：5′-CACATTGGTTTGTTGGTTGC-3′；
SEQ ID NO.4；

Primer125-F：5′-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3′；
SEQ ID NO.5；

Primer125-R：5′-TTTCAACCACCATTAACAAC CA-3′；
SEQ ID NO.6；

Primer128-F：5′-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3′；
SEQ ID NO.7；

Primer128-R：5′-CACATCATGGCTTTCTCCAC-3′；
SEQ ID NO.8；

Primer140-F：5′-CGCAAATTTTTGCAATAGAG C-3′；
SEQ ID NO.9；

Primer140-R：5′-TTTTTAGATTTGGGATAATTC TTACT-3′；
SEQ ID NO.10。

2.2.2 PCR扩增以及杂交种检测

利用能在杂交F1代表现出同时具有父母本特异性条带的引物，对获得杂交种F1进行杂交种的真实性鉴定。利用引物128对结角率与亲和指数均较高的Y5A/春露杂交8株F1代PCR扩增。图1显示，有5株单株扩增到两亲本特异条带，鉴定为真杂种；
其余3株单株只扩增到母本或父本特异性条带，可能为假杂种。

图1 引物128对部分远缘杂交F1鉴定结果

油菜远缘杂交亲和性的大小不仅受环境的影响，也受亲本基因型亲和力的影响。本试验中以不同的不育系为母本和不同材料为父本远缘杂交所得结果不同。以Y5A为母本时，春露为父本的杂交种子数最多，Y5A/春露的杂交种子数有31颗，结角率0.15%，亲和指数0.32。以Y4-2A为母本时，春露为父本的杂交种子数最多，Y4-2A/春露的杂交种子数有12颗，结角率0.06%，亲和指数0.14。油菜远缘杂交过程中父母本的选择和组配至关重要，这和前人研究结果一致[7-10]。

油菜和萝卜的远缘杂交较为困难，要确定杂交配组后获得F1的真实性。本研究通过对甘蓝型油菜、萝卜基因组测序，挑选出能在杂交F1代表现出同时具有父母本特异性条带的合适引物，鉴定F1的真实性。Y5A/春露杂交8株F1中显示有5株单株扩增到两亲本特异条带，鉴定为真杂种。

根肿病近年来已成为十字花科作物上重要的病害之一。我国油菜主产区内根肿病发病严重，对油菜产量造成巨大损失，打击了农民种植积极性，威胁我国油料安全，加强对油菜根肿病的防治研究意义重大。萝卜作为油菜的近缘种，有研究证明其对根肿病的抗性要高于甘蓝和白菜，通过抗病性鉴定，筛选出优良的抗病萝卜品种，进而通过有性杂交和子房培养方法，结合形态学、细胞学及分子检测技术，将油菜近缘种萝卜的抗根肿病基因导入到油菜中，以期获得具有免疫或高抗根肿病的中间材料，进而拓宽甘蓝型油菜的根肿抗病性遗传基础，为应对油菜根肿病抗性基因单一带来的抗性易丧失问题提供更多可供选择利用的种质资源。

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