复方土茯苓颗粒对急性痛风性关节炎兔的抗炎作用

李静， 黄辉， 武鹏， 孙维峰

（中国人民解放军南部战区总医院，广东广州 510010）

痛风性关节炎是由于尿酸盐沉积在软骨、骨质、滑囊、关节囊和其他组织中引起的炎性反应[1]。目前，临床上治疗痛风性关节炎急性期的药物主要有秋水仙碱、非甾体抗炎药、糖皮质激素等[2]，然而，长期服用极易引起肝肾功能受损、胃肠道反应，且症状反复发作[3]。而中医药因其价廉、效专、副作用少等优点受到广泛青睐[4]。复方土茯苓颗粒为本研究组孙维峰教授经验方研制而成的军队医院非标准制剂，已获得国家发明专利（专利号：ZL2007100323.3），该药以利湿泄浊、化痰祛瘀为治则，在临床上使用10 余年治疗高尿酸血症及痛风性关节炎间歇期具有较好的疗效[5-6]。为进一步观察复方土茯苓颗粒对痛风性关节炎的治疗效果，为其临床合理应用提供参考，本研究以急性痛风性关节炎兔模型为研究对象，观察复方土茯苓颗粒的干预作用及机制，现将研究结果报道如下。

1.1 动物 56 只普通级雄性新西兰兔，4 ～5 周龄，体质量1.83～2.3 kg，动物质量合格证号：0023116，购自青岛康大生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2012-0005。饲养在广东莱恩医药研究院有限公司实验动物中心，饲养环境为23 ℃、60%相对湿度、12 h 循环照明，自由进食和饮水。实验方案经广东莱恩医药研究院有限公司IACUC的同意和认可。

1.2 药物与试剂 复方土茯苓颗粒（中国人民解放军南部战区总医院生产，批号：140601）；
秋水仙碱片（西双版纳药业有限责任公司生产，批号：150431）；
痛风舒胶囊（青海绿色药业有限公司生产，批号：150101）。羧甲基纤维素钠（CMC-Na，江苏永华精细化学品有限公司，批号：20120220）；
尿酸钠（美国Sigma公司）；
硫酸多黏菌素B[格雷西亚（成都）化学技术有限公司]；
兔抗白细胞介素（IL）-1β、IL-8 酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（大连泛邦化工技术开发有限公司）。

1.3 仪器 XT-2000iv型血液分析仪（日本希森美康株式会社）；
ASP300S 全自动组织脱水机、EG1150H石蜡包埋机、RM2016切片机、HI1210摊片机、HI1220 烘片机、DM3000（ebp100-04-L 荧光）型生物显微镜、病理图像分析系统DFC450+图像采集软件Leica Application Suite V4（德国Leica公司）；
Elx808型酶标仪（美国BioTek公司）。

1.4 药物制备 尿酸钠，用生理盐水配制成2.5%尿酸钠溶液。硫酸多黏菌素B，用生理盐水配制成10 U/mL工作液。参考《药理实验方法学》[7]，复方土茯苓颗粒成人临床拟用量为每次1.5 g，每天2次口服，即3 g·d-1·人-1，按体表面积折算兔的等效剂量为0.14 g 药粉（2.45 g 生药）/kg。根据上述依据设定复方土茯苓颗粒低、中、高组剂量分别为0.14、0.28、0.56 g/kg，按体表面积等效剂量折算法折算，约相当于成人临床日拟用量（3 g）的1、2、4倍。设阳性对照药物秋水仙碱剂量为0.093 mg/kg，按体表面积等效剂量折算法折算，约相当于成人临床预防日拟用量（1 mg·d-1·人-1）的2 倍。设阳性对照药物痛风舒胶囊剂量为0.336 g/kg，按体表面积等效剂量折算法折算，约相当于成人临床日拟用量（3.6 g·d-1·人-1）的2倍。复方土茯苓低、中、高剂量组，秋水仙碱组，痛风舒组，分别用0.5%CMC-Na溶液适配制成浓度分别为0.028、0.056、0.112 g/mL，0.018 6 mg/mL，0.067 2 g/mL的混悬液。

1.5 动物分组、给药与造模 将新西兰兔随机分为7组，分别为正常组、模型组、秋水仙碱组、痛风舒组及复方土茯苓低、中、高剂量组，每组8 只。动物剂量根据成人剂量以体表面积换算法换算，给药容积为5 mL/kg。各给药组按设定要求灌胃给药，正常组、模型组给予灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，连续9 d。第9天给药后1 h，除正常组外，其余各组进行急性痛风性关节炎造模，方法参考MeCarty 研究[8]：造模前用3%戊巴比妥钠溶液麻醉兔，将兔左膝关节周围脱毛并消毒皮肤，轻弯左膝关节后向关节侧方进针，将2.5%尿酸钠溶液0.4 mL（10 mg）和多黏菌素B 溶液0.1 mL（10 U/mL）注入关节腔，以对侧关节囊鼓起为注入成功标准。每组分别在造模前（0 h）和造模后2、4、5 h，测量左膝关节同一部位的周长，测量3次，取平均值。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 关节液白细胞计数及IL-1β、IL-8 含量测定 以3%戊巴比妥钠溶液麻醉放血处死动物，切取膝关节（胫腓骨上1/3段至股骨下1/3骨段，去除关节周围的肌肉等硬组织，保留完整的关节囊），用0.9%氯化钠注射液1 mL 灌洗关节腔，收集关节液，离心取上清液分装于EP 管中，部分用于进行白细胞计数，其余上清液于-80 ℃保存。应用血液分析仪测定白细胞数目。按ELISA 试剂盒说明书测定IL-1β 和IL-8 水平，使用酶标仪于450 nm 波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算IL-1β、IL-8含量。

1.6.2 HE 染色法观察滑膜组织病理学变化 将滑膜组织以多聚甲醛溶液固定后，3%硝酸脱钙8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脱水；
二甲苯透明，石蜡包埋；
切片后，用苏木素和伊红对切片进行染色；
最后在显微镜下观察并采图。

1.7 统计方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。各组采用Student-T检验（配对T检验）与给药前进行比较统计；
各实验组进行组间比较之前先进行组间方差分析（F检验）。当组间方差齐同时，组间比较采用Student-T检验（非配对的T检验）进行统计；
组间方差不齐时，采用校正的Student-T检验进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 复方土茯苓颗粒对急性痛风性关节炎兔左膝关节肿胀度的影响 表1 结果显示：与正常组比较，模型组兔左膝关节肿胀度增加，造模后2 h肿胀度达到高峰（P＜0.05）；
与模型组比较，各给药组的左膝关节肿胀度得到不同程度减小，其中秋水仙碱组、痛风舒组和复方土茯苓中、高剂量组造模后4 h膝关节肿胀程度明显降低（P＜0.05）。表明复方土茯苓颗粒可明显缓解急性痛风性关节炎兔膝关节肿胀。

表1 各组兔左膝关节肿胀度比较Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

表1 各组兔左膝关节肿胀度比较Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

注：①P＜0.05，与正常组比较；
②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组秋水仙碱组痛风舒组复方土茯苓低剂量组复方土茯苓中剂量组复方土茯苓高剂量组造模后5 h 9.48±0.08 9.96±0.13①9.80±0.11 9.81±0.08 9.82±0.13 9.82±0.08 9.78±0.08兔数/只8888888造模前（0 h）9.52±0.13 9.44±0.05 9.48±0.04 9.48±0.08 9.50±0.09 9.46±0.08 9.50±0.08造模后2 h 9.46±0.05 10.19±0.15①9.86±0.11②9.98±0.19 10.03±0.20 10.00±0.17 9.90±0.16②造模后4 h 9.48±0.04 10.07±0.11①9.80±0.17②9.82±0.11②9.90±0.12 9.84±0.09②9.80±0.09②

2.2 复方土茯苓颗粒对急性痛风性关节炎兔关节炎症的影响

2.2.1 各组兔关节液白细胞计数比较 图1 结果显示：与正常组比较，模型组关节液白细胞计数显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，各给药组关节液白细胞计数未见显著性差异（P＞0.05），但各给药组白细胞计数均有降低的趋势，以复方土茯苓高剂量组降低效果最明显。

图1 各组兔关节液白细胞计数比较Figure 1 Comparison of white blood cell count in joint fluid among various groups of rabbits（）

2.2.2 各组兔关节液炎症因子IL-1β、IL-8 水平比较 图2结果显示：与正常组比较，模型组兔关节液中IL-1β、IL-8 水平显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，各给药组兔关节液中IL-1β、IL-8水平明显降低，其中，复方土茯苓高剂量组、秋水仙碱组、痛风舒组差异有统计学意义（P＜0.05）。提示复方土茯苓颗粒可显著抑制急性痛风性关节炎兔膝关节液中炎症细胞因子的产生。

图2 各组兔关节液炎症因子IL-1β、IL-8水平比较（）Figure 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-8 in the joint fluid among various groups of rabbits（）

2.3 复方土茯苓颗粒对急性痛风性关节炎兔滑膜组织病理学形态的影响 图3结果显示：正常组滑膜细胞呈扁平上皮样，滑膜细胞层下未见炎细胞浸润，深层纤维组织未见明显异常；
模型组可见大量炎细胞浸润，并向深层组织蔓延，主要为淋巴细胞和嗜酸性粒细胞；
秋水仙碱组及复方土茯苓中剂量组可见局部有一些炎细胞浸润，少量向深层组织蔓延；
痛风舒组可见大量炎细胞浸润，少量向深层组织蔓延；
复方土茯苓低剂量组可见大量炎细胞浸润，并向深层组织蔓延；
复方土茯苓高剂量组可见少量炎细胞浸润，未向深层组织蔓延。可见，秋水仙碱组、痛风舒组及复方土茯苓高剂量组滑膜组织炎性细胞浸润和增生较模型组均有不同程度的减轻，其中，复方土茯苓高剂量组改善效果最明显。

图3 各组兔滑膜组织病理学形态比较（HE染色，×100）Figure 3 Comparison of synovial histopathological morphology among various groups of rabbits（HE staining，×100）

尿酸钠致兔急性痛风性关节炎是经典的痛风性关节炎模型。兔是解热、抗炎试验首选动物，白色兔的炎症反应较为剧烈，因此，本研究选用新西兰兔。因药理剂量的雌激素有抗炎与免疫的抑制作用，故选择雄性动物进行试验[9]。有研究[10]显示，痛风性关节炎是中性粒细胞介导的炎症，中性粒细胞与内皮细胞粘连是急性痛风产生的本质。体内尿酸钠晶体作用于血小板、中性粒细胞、滑膜细胞、单核细胞，刺激细胞释放多种炎症介质引起痛风性关节炎的发生，其中IL-1β、IL-8 作为炎症趋化因子和激活因子在痛风性关节炎的发生、发展过程中起重要作用[11]。本研究通过建立兔痛风性关节炎模型主要是考察炎症反应情况，取兔关节腔灌洗液检测白细胞和炎症因子IL-1β、IL-8等炎症因子指标，并观察滑膜组织病理情况。因有必要排除由于内毒素等因素引起的炎症所造成的炎症因子升高，而多粘菌素B是针对革兰阴性菌的窄谱抗生素，主要用于局部给药，如烧伤创面等，其全身吸收性差，口服不吸收，局部用药对动物影响较小，因此，本研究选用多粘菌素B作为辅助抗生素添加[9]。

复方土茯苓颗粒是本院孙维峰教授根据岭南地区高尿酸血症患者的病机特点及临床治疗经验研制出的中药制剂。方中土茯苓为君药，健脾除湿，泄浊解毒，通利关节；
萆薢助君药分清泄浊、祛风湿，为方中臣药；
佐使药王不留行活血通络利水，山慈菇能清热解毒、消痈散结，牛膝活血通经、利尿通淋，引萆薢、土茯苓等药到达下焦，从而泻体内痰湿瘀血等浊邪于体外。全方共奏利湿泄浊、化痰祛瘀之功。该方降尿酸的疗效已得到临床及动物实验的证实[12-15]。本课题组前期现究在细胞水平发现，复方土茯苓颗粒含药血清可通过上调大鼠滑膜细胞miR-146a 的表达，抑制IL-1β/IL-6，从而缓解炎症反应[16]。为进一步探讨复方土茯苓颗粒的抗炎作用，本课题组构建了尿酸钠诱导的急性兔痛风性关节炎模型，观察其对炎症反应的影响。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组兔左膝关节明显肿胀，关节液白细胞计数显著升高，关节液IL-1β、IL-8水平显著升高，滑膜组织病理学结果可见，膝关节囊内滑膜表面及滑膜细胞下层炎细胞分布密集，主要为淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，并向深层纤维组织蔓延的趋势，表明痛风性关节炎兔模型构建成功。经过预防性给药后，秋水仙碱组和复方土茯苓高剂量组膝关节肿胀程度较模型组明显降低（P＜0.05），复方土茯苓中、高剂量组关节液白细胞计数与模型组比较有降低趋势，复方土茯苓高剂量组、秋水仙碱组、痛风舒组兔关节液中IL-1β、IL-8水平较模型组明显降低（P＜0.05），秋水仙碱组、痛风舒组及复方土茯苓中、高剂量组滑膜组织炎性细胞浸润和增生较模型组均有不同程度的减轻，其中，复方土茯苓高剂量组改善效果最明显。表明复方土茯苓可一定程度地抑制痛风性关节炎兔的炎症反应，以高剂量效果最佳。在减低膝关节肿胀度方面，复方土茯苓颗粒的疗效与秋水仙碱相当，在抑制炎症因子、减轻滑膜炎症方面，复方土茯苓颗粒的疗效与秋水仙碱和痛风舒胶囊均相当，而在减少关节液白细胞聚集方面，复方土茯苓颗粒的疗效优于秋水仙碱和痛风舒胶囊。

综上所述，复方土茯苓颗粒有一定的抗急性痛风性关节炎作用，可明显减轻急性痛风性关节炎兔关节肿胀，降低关节液白细胞数量及IL-1β、IL-8水平，改善滑膜炎症，以高剂量效果为最佳。

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